COVID-19，一种由SARS-CoV-2病毒感染所引起的疾病，现已成为全球范围内的流行病。截止到年4月24日，全球个国家已有2,,例确诊病例，包括,例死亡病例。目前对这种新型病毒和它的致病机制依然了解的很少。黄超兰团队在年11月份发表在NatureCommunications上的工作，揭示了新冠发病机制或存在“两阶段”模式。
作者｜裴晓如
在此次流行之初，研究的重点是对于重症和危重症病人的管理和治疗。统计学数据显示，老年人，尤其是患有心脏病、肺部疾病、肥胖和糖尿病的老年人的症状最为严重。随着病毒在全球范围内的蔓延，30-50岁之间的年轻感染者也日益增多。在越来越多的病例中，预期会改善的症状却会突然恶化。患者可发展为急性呼吸窘迫综合征（ARDS），甚至突然死亡。这种突然的变化暗示着疾病进展的“两阶段”模式，但是其内在的机制尚不清楚。
在这项工作中，作者以质谱为基础，数据非依赖采集（DIA）定量蛋白质组技术分析了来自COVID-19感染者、健康捐献者和非COVID-19感染的肺炎患者的尿液样本（图1a）。发现在COVID-19患者中特异性地发生了免疫抑制和紧密连接（TJ）损伤。有趣的是，在感染后期免疫应答在一定程度上被激活。这些数据提供了一个与COVID-19疾病相关的分子改变图谱，并且提供两阶段发病机制可能发生的线索。
Results
COVID-19疾病的尿液蛋白质组分析
作者收集了14例经鼻咽拭子实时PCR检测SARS-CoV-2感染阳性的患者，其中6位女性和8位男性，年龄在30-77岁之间。医院主治医师提供的信息，将14例COVID-19患者分为9例中重度患者和5例重症患者。两组对照组为13例非COVID-19感染的肺炎患者和10例健康人群。
原始数据标准化后进行主成分分析（PCA），作者的数据显示出在不同队列之间的显著分层。为了进行数据分析，作者首先比较了COVID-19感染者、健康捐献者和非COVID-19感染的肺炎患者这三个队列。在所有37例样本中，共检测到种蛋白。相较于健康捐献者和非COVID-19感染的肺炎患者，其中种蛋白的表达水平发生了显著改变（图1b）。有趣的是，作者在COVID-19感染者中鉴定到的下调蛋白数量是上调蛋白数量的十倍（图1c）。KEGG富集分析揭示了与COVID-19感染相关的分子图谱。超过十种信号通路出现显著改变。值得注意的是，COVID-19对于免疫相关通路、TJ通路和代谢相关通路有强烈影响（图1c）。
图1定量尿液蛋白质组分析
免疫系统在COVID-19疾病早期被抑制
作者发现大量与免疫应答相关的蛋白被下调，这表明在COVID-19患者中免疫应答被抑制。在COVID-19患者中，作者观察到蛋白酪氨酸磷酸酶受体C型、瘦素和抗酒石酸磷酸酶5型（参与淋巴细胞的减少）和血小板碱性蛋白的剧烈减少（图2a）。这些结果与COVID-19患者血液检测的低淋巴细胞和血小板计数现象相一致。补体C3，补体C1q亚基C，补体C1r亚基和PZP样α-2-巨球蛋白域蛋白8被下调，这表明补体系统明显受损。FcγR介导的吞噬作用中涉及的脾脏酪氨酸蛋白激酶水平显着降低，表明微噬细胞，嗜中性粒细胞，自然杀伤细胞和单核细胞的吞噬作用受到抑制（图2a）。据报道，在COVID-19患者从轻症过渡到重症期间，血清中的载脂蛋白A-I水平降低。作者还观察到COVID-19患者载脂蛋白A-IV（APOA4）和载脂蛋白E的下调，这些可能与巨噬细胞功能有关。
此外，作者还观察到与趋化因子信号通路相关的蛋白水平的下降。COVID-19患者的C-C基序趋化因子14，C-C基序趋化因子18和C-X-C基序趋化因子配体12被显著下调，表明单核细胞活化，B细胞迁移和T细胞介导的免疫反应降低（图2a）。中性粒细胞趋化因子C-X-C趋化因子受体2型和信号转导子和转录激活子3、5B和6同样被下调，这表明中性粒细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞的细胞因子产生和脱颗粒作用受损。
急性缺氧和ARDS是COVID-19患者高致死率的两个主要原因。先前的研究表明，肺泡上皮屏障通透性显著增加导致肺泡水肿和渗出物形成，是导致ARDS低氧血症的主要因素之一。肺上皮的屏障功能依赖于一组TJ异构体复合物，它封闭了相邻上皮细胞之间的界面。TJs同样存在于其他器官的上皮细胞之间，例如肠、肾和脑。TJ复合体的破坏是病毒感染过程中上皮屏障破坏的主要原因。作者发现，在COVID-19患者中，许多参与TJ形成和细胞间粘附连接的蛋白被显著下调，包括TJ蛋白ZO-1，TJ蛋白ZO-2，紧密连接蛋白-2/3/11/19，丝状肌动蛋白结合蛋白抗体，扣带蛋白，蛋白碎屑同源物3，cAMP依赖的蛋白激酶催化亚基α（PRKACA）和RhoGTPase激活蛋白17在COVID-19患者中被显著下调（图2b）。这表明在病毒侵袭的过程中可能改变了细胞间TJ的形成和上皮形态的形成。这反过来可能会破坏保护基底组织的物理屏障。
图2COVID-19患者中的种特异性蛋白功能分析
与健康队列和非COVID-19感染的肺炎患者相比，COVID-19患者尿液中显著上调或下调的蛋白中，包括MT-1G、LPL、β2M、PRKACA、FOLR2和APOA4呈现出明显的变化（图2c）。
这些蛋白是COVID-19诊断的潜在生物标志物，并可以使诊断更加精确。值得注意的是，6个蛋白中有4个与免疫应答和TJs相关，这是在COVID-19患者中发现的两个特征性通路。
重症COVID-19患者免疫应答被激活
图3中度和重度COVID-19患者的免疫系统应答
据报道，在COVID-19患者的晚期会发生细胞因子风暴。要了解COVID-19的发病机制，就必须阐明在疾病发展过程中过渡是如何发生的。为了进一步调查，作者将COVID-19患者分为9例中症病例和5例重症病例。PCA显示，中度和重度COVID-19患者样本分离良好。基因本体富集分析（GOEA）显示，大多数上调蛋白参与补体和凝血级联、自然杀伤细胞介导的细胞毒性和血小板活化（图3a）。通过对中症和重症亚群的观察，作者发现，在疾病晚期出现了一定程度的免疫应答激活，而免疫抑制作用在早期仍然存在（图3b和3c）。这些结果表明，在疾病晚期，免疫应答被激活，这与COVID-19重症和危重症患者的过渡免疫反应和细胞因子风暴是一致的。作者的研究还鉴定了两个特征蛋白，IGLV3-25和EEF1A1，它们可能表明COVID-19疾病的两个阶段的进展（图3d）。
图4COVID-19发病机制的“两阶段”模型
Discussion
作者应用最先进的质谱技术对COVID-19患者、健康对照者和非COVID-19感染肺炎患者的尿液样本进行了定量蛋白质组学分析。发现了蛋白质结构的变化，这些变化揭示了COVID-19患者感染初期的免疫抑制和紧密连接受损。有趣的是，作者在感染后期检测到一定程度的免疫激活（图4）。这些数据为理解患者的临床症状提供了重要的基础，并将阐明感染的两个阶段是如何进行的。作者的数据同时证明，应该更多地